高效液相色譜儀原理及操作步驟

之恒儀器

原理
分離原理：利用不同物質在固定相和流動相之間的分配系數差異進行分離。固定相是填充在色譜柱內的多孔顆粒或化學鍵合相，流動相是攜帶樣品通過色譜柱的液體。當樣品注入流動相后，由于不同組分在固定相和流動相之間的分配能力不同，在色譜柱中移動的速度也不同，從而實現分離。
檢測原理：分離后的各組分依次通過檢測器，檢測器根據物質的光學、電學或其他物理化學性質對其進行檢測，將組分的濃度信號轉換為電信號，記錄下來得到色譜圖。常用的檢測器有紫外 - 可見光檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器等。

操作步驟
1. 準備工作
檢查儀器：確保儀器各部件正常，包括泵、檢測器、進樣器等，檢查儀器的電源線、信號線是否連接良好。
選擇色譜柱：根據樣品的性質和分析目的選擇合適的色譜柱，如反相柱、正相柱、離子交換柱等，并將其正確安裝在儀器上。
配制流動相：按照實驗要求配制合適的流動相，通常需要對流動相進行過濾和脫氣處理，以去除其中的雜質和氣泡，防止對色譜柱和儀器造成損害。
準備樣品：將樣品進行適當的預處理，如提取、凈化、濃縮等，使其符合進樣要求，并將樣品溶解在合適的溶劑中，配制成一定濃度的樣品溶液。
2. 儀器調試
開啟電源：依次開啟高效液相色譜儀的各個部件電源，如泵、檢測器、柱溫箱等，等待儀器自檢完成。
平衡色譜柱：用流動相沖洗色譜柱，使色譜柱達到平衡狀態。平衡時間一般需要 30 分鐘至數小時不等，直到基線穩定。
設置儀器參數：根據實驗要求設置泵的流速、檢測器的波長、柱溫箱的溫度等參數。流速通常在 0.5 - 1.5 mL/min 之間，檢測器波長根據樣品的吸收特性進行選擇，柱溫一般控制在 25 - 40℃。
3. 進樣分析
進樣：使用進樣器將適量的樣品溶液注入到流動相中，進樣量一般在幾微升至幾十微升之間。進樣方式有手動進樣和自動進樣兩種，手動進樣需要使用微量注射器準確吸取樣品溶液，然后注入進樣口;自動進樣則可以通過自動進樣器按照預設的程序進行進樣。
分離檢測：樣品進入色譜柱后，在流動相的推動下進行分離，分離后的各組分依次通過檢測器進行檢測，檢測器將檢測到的信號轉換為電信號，并傳輸到數據處理系統。
記錄色譜圖：數據處理系統記錄下檢測器輸出的電信號，形成色譜圖。色譜圖中橫坐標為保留時間，縱坐標為信號強度，每個峰代表一個組分，根據峰的保留時間和峰面積可以對樣品中的各組分進行定性和定量分析。
4. 結果處理
定性分析：通過比較樣品中各組分的保留時間與標準品的保留時間，確定樣品中各組分的種類。
定量分析：根據色譜峰的面積或峰高，采用外標法、內標法或歸一化法等方法計算樣品中各組分的含量。外標法是通過繪制標準曲線，將樣品中組分的峰面積與標準曲線進行比較來計算含量;內標法是在樣品中加入一定量的內標物，根據樣品和內標物的峰面積比值來計算含量;歸一化法是假設樣品中所有組分都出峰，根據各組分峰面積占總峰面積的比例來計算含量。
5. 儀器清洗與關機
清洗色譜柱：分析完成后，用適當的溶劑沖洗色譜柱，去除殘留的樣品和雜質。一般先用流動相沖洗一段時間，然后再用甲醇、乙腈等有機溶劑沖洗。沖洗時間根據色譜柱的污染程度而定，一般為 30 分鐘至數小時。
關閉儀器：關閉泵、檢測器、柱溫箱等部件的電源，關閉儀器的總電源。如果長時間不使用儀器，應將色譜柱取下，用保護柱帽密封好，妥善保存。

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